（酶联免疫法）

 1 原理及用途

伏马毒素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌产生的真菌毒素，目前已知有28种衍生物，其中以伏马毒素B1（FB1）*为普遍，研究也*为深入，现已发现玉米及其制品，如动物饲料均易被FB1造成污染。FB1毒性在伏马毒素中*强，对多种动物有较严重的毒理作用。研究表明FB1可引发马的白脑软化症，猪的肺水肿综合症，此外，还可诱发人类的食道癌和肝癌、胃癌等疾病，对畜牧业和人类的健康构成危害。

试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的伏马毒素B1和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗伏马毒素B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含伏马毒素B1含量成负相关，与标准曲线比较乘以样本稀释倍数即可得出样本中伏马毒素B1的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.5ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃，30min～15min

2.3 检测下限：

玉米、饲料…………………………75ppb

2.4 交叉反应率：

伏马毒素B1…………………………100%

 2.5 样本回收率：

饲料…………………………………95±15%

玉米…………………………………100±15%

3 试剂盒组成

酶标板……………………………96孔

标准液（黑盖）：各1ml

0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

酶标记物（红盖）…………………5.5ml

抗体工作液（蓝盖）………………5.5ml

底物液A（白盖）……………………6ml

底物液B（黑盖）……………………6ml

终止液（黄盖）………………………6ml

10×浓缩复溶液（黄盖）……………50ml

20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml

说明书…………………………………1份

盖板膜…………………………………1张

自封袋…………………………………1个

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：复溶液

将10×浓缩复溶液用去离子水10倍稀释（1份10×浓缩复溶液加9份去离子水），复溶液在4℃环境可保存一个月。

配液2：工作洗涤液

将浓缩洗涤液20倍稀释(1份洗涤液加19份去离子水)。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 玉米、饲料处理方法 

1）称取1g粉碎样品于50ml离心管中，加5ml去离子水，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取上清0.1ml，加入0.9ml复溶液，振荡混匀30s；

3）取50μl进行分析。

样本稀释倍数：50      检测下限：75ppb

（若样本中伏马毒素B1的含量较高，可在步骤2）按比例增大稀释倍数，检测出的含量乘以样本实际的稀释倍数即为样本中的含量）

6 酶联免疫试验步骤

    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应30分钟。

6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用工作洗涤液350µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 显    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。

6.5 终    止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

8 注意事项

8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。           

9 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。

保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。

原创作者：上海臻科生物科技有限公司